蛋白质印迹 (WB) 广泛用于分析细胞或组织提取物中的特定蛋白质表达。在 Cell Signaling Technology (CST)，我们了解蛋白质印迹实验非常耗时，而且它们的成功对您的研究进展有着至关重要的影响。出于这个原因，我们精心开发抗体并提供优化的方案以及参考信息和技术支持，以使您的蛋白质印迹实验获得成功。
对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗以 5% w/ v BSA 或脱脂奶粉、1X TBS、0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动过夜。
使用 Cell Signaling Technology 蛋白质印迹实验方案的原因
注意：推荐的一抗稀释缓冲液和推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。
A。溶液和试剂从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
了解我们的解决方案和试剂
注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，mix.10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：添加 100 ml 10X 至 900 ml dH2O，mix.1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包（#12498） 7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：添加 100 ml 10X Trans将缓冲液加入 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O，混合。Nonfat Dry牛奶：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 % BSA 或 5% 脱脂奶粉，如一抗产品网页所示；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 或脱脂奶粉添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白梯检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329) . 印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。检测试剂：LumiGLO® 化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL 试剂 (#6883).B.蛋白质印迹样品制备的通用方案。样品制备、SDS-PAGE 和转移
通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。保持在冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。
注意：上样预染分子量标记（#59329，5 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。
电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.会员ane 封闭和抗体孵育封闭和抗体孵育
注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。
I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育根据所用的一抗进行以下一组特定步骤。
对于未偶联的一抗孵育膜和一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度和稀释剂） 10 ml 一抗稀释缓冲液，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与适合物种的 HRP 偶联二抗（#7074 或 #7076，1:2000）孵育和抗生物素、HRP 连接的抗体（#7075，1:1000–1:3000）可检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物，室温下轻轻搅拌 1 小时。用 15 ml TBST。继续检测（D 部分）。对于 HRP 偶联一抗将膜和一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。洗涤用 15 ml TBST 孵育 3 次，每次 5 分钟。与抗生物素、HRP 连接的抗体（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测生物素化蛋白质标记物，在 10 ml 封闭缓冲液中轻轻搅拌在室温下放置 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。对于生物素化一抗，将膜和一抗（按产品数据表中推荐的适当稀释度）在 10 μL 中孵育ml 一抗稀释缓冲液在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用 Streptavidin-HRP（适当稀释的#3999）在 10 ml 封闭缓冲液中孵育膜，轻轻搅拌 1 小时室温。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。不添加用于检测生物素化蛋白标记物的抗生物素、HRP 连接抗体。没有必要。 Streptavidin-HRP 也将可视化生物素化标记。
D.蛋白质检测蛋白质检测
用 10 ml LumiGLO®（0.5 ml 20X LumiGLO® #7003、0.5 ml 20X Peroxide 和 9.0 ml 纯净水）或 10 ml SignalFire™ # 孵育膜6883（5 毫升试剂 A，5 毫升试剂 B）在室温下轻轻搅拌 1 分钟。排出膜上多余的显影液（不要让其干燥），用保鲜膜包裹并暴露在 X 射线胶片上。最初的 10 秒曝光应该表明合适的曝光时间。
注意：由于检测反应的动力学，信号在孵育后立即最强，并在接下来的 2 小时内下降。
2005 年 6 月发布
2016 年 6 月修订
支持：877-678-8324 [电子邮件受保护] • 订单：877-616-2355 [电子邮件受保护] • 网站：www.cellsignal.com
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