对于荧光蛋白质印迹，我们强烈推荐使用 TrueBlack® 荧光蛋白质印迹封闭缓冲液试剂盒 #40683。该试剂盒经过专门配制，可通过阻断荧光团标记的抗体与蛋白质印迹膜之间的非特异性相互作用来提高荧光蛋白质印迹分析的特异性和灵敏度。与标准抗体稀释剂和封闭缓冲液相比，使用 TrueBlack® 荧光蛋白质印迹封闭缓冲液试剂盒时，这会导致背景更少，目标信号更亮。如果使用此套件，请使用产品网页或数据表上的套件特定协议。
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西使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上）、Akt（ pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（中）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下）。蛋白质印迹膜用我们的标准抗体稀释剂和封闭缓冲液（左）或 TrueBlack® 荧光蛋白质印迹封闭缓冲液试剂盒（右）处理。使用 TrueBlack® 荧光蛋白印迹封闭缓冲液试剂盒时，可以看到抗体灵敏度提高和背景荧光降低。
注意：双色蛋白印迹需要一抗来自不同物种的抗体和用不同染料标记的适当二抗。表位重叠可能会造成干扰，在双色蛋白质印迹中应予以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，请测试每个 prima在两种缓冲液中分别进行实验，以确定双标记实验的最佳缓冲液。
对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA 或脱脂奶粉、1X TBS、 0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动，过夜。推荐的一抗稀释缓冲液和推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。
A.溶液和试剂注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS至 950 ml dH2O，mix.10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X TBS 添加至 900 ml dH2O，mix.1X SDS 样品缓冲液：蓝色装载包 (#7722)或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。用 dH2O.10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液稀释至 1X：(#4050)准备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液 900 ml dH2O，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539) 要准备 1 L 1X 转移缓冲液：添加 100 ml 10X 转移缓冲液 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O，混合。含 Tween® 20 的 10X Tris 缓冲盐水 (TBST-10X)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O 中，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBS；对于 150 毫升，将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBS 中并充分混合。 Tween® 20 不应存在于封闭缓冲液中，因为它会自动发出荧光并增加非特异性背景。封闭步骤后，可将 Tween® 20 重新引入后续稀释缓冲液中。洗涤缓冲液：1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA 或 5% 脱脂干粉如一抗数据表所示的牛奶；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 或脱脂奶粉加入 20 ml 1X TBST 中并充分混合。二抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% 脱脂奶粉；对于 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉加入 20 ml 1X TBST 中并充分混合。 （二抗；抗兔 #5151 和 #5366；抗小鼠 #5257 和 #5470）。预染蛋白标记物，宽范围 (11-190 kDa)：(#13953)。印迹膜和纸：(#12369)该协议已针对硝酸纤维素膜进行了优化（推荐）。一般建议使用 0.2 µm 的孔径。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用冷的 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板的每孔 100 µl 或 10 cm 直径板的每板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。保持在冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 英里名词；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。
注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/泳道）建议验证电转移和确定分子量。预染标记在近红外波长处是自发荧光的。
电转移到硝酸纤维素膜 (#12369)。C。膜封闭和抗体孵育注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同大小的膜，相应地调整体积。
（可选）转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。在室温下将膜在 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时.
关键步骤：封闭缓冲液中不要加入 Tween® 20（A 部分，步骤 8）。
用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。孵育膜和一抗（按照产品数据表中的建议进行适当稀释）10 ml primary 抗体稀释缓冲液在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用荧光团偶联的二抗（#5470、#5257、#5366、#5151）孵育膜（1： 5000–1:25,000 稀释 1 mg/ml 原液）在 10 ml 二抗稀释缓冲液中，室温下轻轻搅拌 1 小时。用 15 ml TBST.D 洗涤 3 次，每次 5 分钟。蛋白质检测排出多余 TBST 的膜并使其干燥。
关键步骤：膜必须干燥才能进行荧光染色。
按照制造商的建议使用合适的荧光扫描仪扫描膜。2022 年 3 月发布
2022 年 3 月修订
如有任何问题，请联系我们。
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